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      純化的原代細胞方法

      日期:2022-07-29 09:20
      瀏覽次數:4
      摘要: 原代細胞分離的方法有多種,常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法,下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細胞。 一、胰蛋白酶 純化法 1.在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗2到3次。 2.將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。 ...

      原代細胞分離的方法有多種,常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法,下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細胞。

      一、胰蛋白酶 純化法


      1.在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗2到3次。


      2.將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。


      3.在4℃孵育6到18小時,使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。


      4.移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。


      5.在組織碎片加入熱的完全培養基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。


      6.通過無菌不銹鋼絲網(100~200 mm)過濾,分散所有剩余組織。計數和接種細胞,進行培養。


      二、膠原酶純化法


      1.用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。


      2.加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。


      3.在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。


      4.通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。


      5.通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。


      6.再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。


      三、Dispase純化法


      1.用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。


      2.加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液)


      3.在37℃孵育20分鐘到幾個小時。


      4.通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。


      5.通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。


      6.再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。

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